TP enzymes 2ième partie

TP n°3: Les enzymes; structure et propriétés.

Les enzymes présentent une double spécificité: spécificité d'action, et de substrat. Les propriétés des enzymes dépendent de leur structure spatiale. la structure tridimentionnelle des protéines peut être affectée par des changements de la séquence des acides aminés (mutations) mais aussi par des facteurs de l'environnement comme le pH, la température, la présence d'ions.

Quelle est l'influence de ces paramètres sur l'activité des enzymes?

1°- Température du milieu et catalyse enzymatique.

On étudie l'action de la température sur une enzyme salivaire: l'amylase qui hydrolyse l'amidon.
Quels sont les produits que l'on obtient lorsque l'amidon est hydrolysé?
Ecrire la ou les réactions.
On inscrit dans un tableau, le temps mis par l'enzyme pour hydrolyser l'amidon. (1g d'amidon = Q)

température
en °C
- 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Temps en
minutes
/
100
56
42
29
20
16
13
10
9.6
12
19
91
/

Avec le tableur Excel, tracez la courbe de la vitesse de la réaction en fonction de la t°. (rappel V = Q : tps).
Commentez la courbe obtenue.
Vous préciserez quelle est la différence entre inactivation et dénaturation.

2°- pH du milieu et catalyse enzymatique.
Tracez les courbes des activités des enzymes en fonction du PH. L'activité est mesurée en unités arbitraires. Vous utiliserez une couleur par courbe.
pH
1
1,2
1,4
1,6
2
3
4
5
6
7
8
8,5
9
10
trypsine
0
0
0
0
0,5
2
9
11,7
12
11
5
3
1
0
maltase
0
0
0
0
0
0
0,2
1
2,2
4,5
8
11
7
1,1
pepsine + S1
0
9
7
2,5
1,5
0,9
0,7
0,3
0,2
0
0
0
0
0
pepsine + S2
0
0,2
1,1
2,5
4
6,6
9,2
8,2
3,5
1
0
0
0
0
pepsine + S3
0
3,7
6,2
9
7
1,6
0
0
0
0
0
0
0
0

Commentez les courbes obtenues.
Chercher dans quelle partie de l'appareil digestif de l'homme se trouvent ces enzymes et quel est le pH de ces différentes parties.

3°- Structure de la Carboxypeptidase par imagerie moléculaire.

Lancer RASMOL ; ouvrir le fichier " cpaseul ". Observer que 3 fenêtres sont ouvertes :

  • Fenêtre Menu Principal
  • Fenêtre Command Line
  • Fenêtre de visualisation de la molécule

Organiser les 3 fenêtres de manière à accéder facilement à chacune d'elles.
Passer en revue les différents modes de représentation (menu Afficher).
Faire tourner la molécule en tous sens.
Demander les informations sur la molécule (menu Fichier) : elles s'affichent dans la fenêtre Command Line

Quelle est la forme de cette enzyme ?
Combien de groupements (AA) ?

1. La structure primaire de la protéine.
Utiliser l'affichage squelette carboné avec coloration par AA.
Quelle est la disposition des acides aminés ?
Quel est le nom du premier acide aminé ? (clic gauche)
Quel est le nom du dernier acide aminé ?
Quelle est la séquence des 5 premiers acides aminés ?

Utiliser une représentation en bâtonnets ou en sphères (les atomes d'hydrogène ne sont pas représentés).
Quels sont les atomes qu'on retrouve dans tous les acides aminés ?
Quels sont les atomes qui ne sont présents que sur certains acides aminés ?

2. La structure secondaire de la protéine
Fermer " cpaseul " et ouvrir " helice " (portion de la molécule d'hémoglobine).
Afficher squelette carboné en surimpression et coloré par formes des aa. Puis afficher en rubans, sans surimpression.

Combien d'acides aminés dans cette chaîne ?
Combien de tours d'hélice ?
Combien d'acides aminés par tour d'hélice ?

Fermer " helice " et ouvrir " feuillet "(portion d'un anticorps). Utiliser la meilleure représentation.

Combien d'acides aminés dans cette chaîne en feuillet ?
Combien de fragments de chaîne composent ce feuillet ?
Comment ces fragments sont-ils disposés dans le feuillet ?
Est-ce une structure en feuillet " pure " ?;

Ouvrir le fichier " cpaseul ". Afficher le squelette carboné sans surimpression coloré par structure.
A quoi correspond la couleur rouge ? Combien y en a-t-il ?
A quoi correspond la couleur jaune ? Combien y en a-t-il ?
A quoi correspondent les autres couleurs ?

3. La structure tertiaire de la protéine
Afficher Boules et bâtonnets et colorer par type d'atomes pour visualiser les acides aminés soufrés (MET et CYS).
Zoom : MAJ + bouton gauche glissé - Recentrage : bouton droit glissé.

Combien y a-t-il d'atomes de soufre?
Participent-ils tous à des ponts disulfures?
Pont disulfure = liaison covalente entre les atomes de soufre de deux AA :
®-S-H + ®-S-H + 1/2 O2 ®-S-S-® + H2O;
Quels autres facteurs de réalisation d'une structure tertiaire connaissez-vous?
Fermer, puis rouvrir le fichier " cpaseul " . Menu : Editer/Sélectionner/ cliquer sur l'étiquette Ac. Aminés
Faire tourner la molécule : Que remarquez-vous ?
Zoom - Nature de cet élément ? (clic gauche)    
Fermer le fichier " cpaseul " (enzyme seul) et ouvrir " sub " (substrat). Afficher en sphères. Menu : Fichier/Séquence
Ecrire la formule chimique développée du substrat (compléter avec les hydrogènes non représentés). Quelle est la nature de ce substrat ?
La spécificité de fonction de la carboxypeptidase est l'hydrolyse. Quel substrat de cette enzyme n'est pas représenté ?
Réfléchir au nom de cette enzyme ; que signifie-t-il ?
4. Le complexe enzyme-substrat
Ouvrir " cpasub " (enzyme +substrat). Effectuer les manipulations suivantes :
Commande  Select *S (puis entrée) : Sélectionne les atomes du substrat
Menu           Afficher Sphères
Menu           Colorer/Atomes/Vert/En cours : Permet de visualiser le substrat (en vert). Le substrat s'installe sur une région particulière de l'enzyme appelée site actif
Commande  Select all (puis entrée) : Sélectionne tous les atomes
Commande  Select within(6.0,*S) (puis entrée) : Fonction particulière de Rasmol qui permet de sélectionner le substrat et tous les atomes à proximité (ici à 6 Å) de la chaîne S = Substrat (donc du site actif) substrat en vert et atomes voisins en sphères colorées selon la nature des atomes.
Menu           Afficher/Sphères                         
Souris          Maj+ bouton gauche glissé : Zoom sur site actif
Souris          Cliquer sur les carbones du site actif. Lire dans la fenêtre Command Line.

Quels sont les AA (et leur position) à proximité du substrat ?
Quelle remarque pouvez-vous faire quant à leur position dans la séquence de la protéine enzymatique ? N'y a-t-il que des AA ?

Parmi les acides aminés de l'enzyme à proximité du substrat, les spécialistes considèrent que :
Trois appartiennent au site catalytique proprement dit : HIS69, GLU72 et HIS196
Trois appartiennent au site de fixation : ARG145, TYR248 et GLU270
Mettre en évidence les AA du site actif et ceux du substrat (utiliser la commande "select his69,glu72, his196" puis colorer)
Si vous avez le temps, sélectionnez TYR 248 sur l'enzyme seul et sur l'enzyme + substrat : la chaîne latérale se déplace d'environ 1,2nm au dessus du substrat et ferme le site actif !

Partager sur

index

J@©QUES FLORIMONT
Modifié le 25.12.2012